terimakasih Tuhan, Kau ajar ku mengerti.. ini belum terlambat untuk aku memperbaiki semuanya. Terimakasih untuk kasih Mu yang selalu dapat aku rasakan sampai saat ini. dengan kehadiran orang-orang yang begitu luar biasa. aku mau menjaga semua ini Tuhan. biarlah Engkau yang bekerja dalam hidupku.. aku lepaskan semua kekhawatiran, semua beban yang terasa sangat berat dalam kuasaMu. biarlah aku melihat dengan mataMu, sehingga aku memiliki cara pandang yang benar. Tuhan, terimakasih Engkau hadir dalam hidupku.. :)
Makna kasih yang sesungguhnya
Minggu, 16 Oktober 2011
Jumat, 14 Oktober 2011
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ACETOBACTER
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Peranan bakteri baik yang menguntungkan ataupun yang merugikan dalam kehidupan kita dapat diketahui melalui proses isolasi dan identifikasi. Prinsip isolasi bakteri adalah memisahkan suatu mikroba dari mikroba lainnya sehingga diperoleh kultur murni. Identifikasi dilakukan setelah kultur murni yang berasal dari satu progeni didapatkan untuk diketahui potensinya. Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Yang paling sering dilakukan adalah teknik cawan gores dan cawan tuang, dimana kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan mikroorganisme sehingga individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya, dengan anggapan bahwa setiap koloni terpisah yang nampak pada cawan petri setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal (Hadioetomo, 1985).
Proses identifikasi bakteri didasarkan pada berbagai macam sifat bakteri seperti sifat biokimia, morfologi koloni, dan morfologi selnya. Pengamatan dan pencatatan ciri morfologi serta ciri lainnya merupakan tahap pendahuluan yang penting sebelum identifikasi. Tingkat keakuratan identifikasi bergantung pada ketelitian dan kerja preparasi seperti pembuatan media, pembuatan reagen, pewarnaan dan ketelitian dalam melakukan, mengamati dan mencatat hasil uji. Ketika suatu spesies belum dapat diidentifikasi seperti spesies asing atau baru, kita dapat menduga bahwa kultur tersebut tidak murni lagi atau kita sudah membuat kesalahan dalam observasi dan pengamatan. Isolat murni yang didapat nantinya akan dapat digunakan untuk produksi biomassa, hasil fermentasi seperti metabolit primer atau metabolit sekunder (Pelczar dan Chan, 1988).
Langkah awal dalam proses identifikasi adalah pengamatan dan pencatatan ciri morfologi serta ciri lainnya. Identifikasi bakteri didasarkan pada berbagai macam sifat bakteri seperti sifat biokimia, morfologi koloni dan morfologi selnya. Menurut Lay (1994), morfologi mikroorganisme berdasarkan bentuk, ukuran dan penataan biasanya tidak cukup untuk melakukan identifikasi. Ciri lainnya seperti sifat pewarnaan, pola pertumbuhan koloni, reaksi petumbuhan pada karbohidrat, dan penggunaan asam amino sangat membantu dalam identifikasi mikroba. Menurut Barrow and Feltham (1993), uji Indol-Methyl red-Voges Proskauer-Citrate (IMViC) digunakan juga sebagai uji untuk karakteristik dari mikroorganisme.
Identifikasi dilakukan untuk mengetahui spesies bakteri wild tipe yang diperoleh untuk selanjutnya digunakan untuk berbagai keperluan; selain itu proses tersebut juga berfungsi untuk mengecek ulang (uji konfirmasi) isolat yang telah diketahui spesies dan karakternya, sehingga dapat memperkecil kesalahan pada hasil uji yang dilakukan. Identifikasi dan klasifikasi mikroorganisme haruslah diketahui terlebih dahulu karakteristik atau ciri-ciri mikroorganisme. Ukurannya yang sangat kecil, tidaklah memungkin bagi kita untuk mempelajari satu mikroorganisme saja, sehingga yang dipelajari adalah karakteristik suatu biakan yang merupakan populasi dari suatu mikroorganisme. Biakan murni yang mengandung hanya satu macam mikroorganisme ini kemudian baru ditentukan spesiesnya (Bisset,1963).
Pendekatan yang dapat dilakukan dalam uji identifikasi yaitu dengan pendekatan konvensial (mikrobiologis) dan pendekatan molekuler. Pendekatan yang banyak dan umum digunakan yaitu pendekatan konvensional (mikrobiologis) dan pendekatan molekuler (analisis fragmen gen 16 S). Pendekatan secara molekuler dilakukan dengan mencocokkan urutan basa gen 16 S isolat uji dengan data yang ada dipangkalan data gen/gen bank, kemudian dianalisis kedekatan hubungan dan kemiripannya (homologinya). Pada pendekatan molekuler, tahapan pertama proses untuk mendapatkan fragmen gen 16 S yang akan di sekuens (proses untuk mengetahui urutan basa N), yaitu dilakukan isolasi DNA kromosomal sel (DNA kromosom secara keseluruhan). Pendekatan mirobiologis biasanya dengan menumbuhkan pada media tertentu sehingga dapat diamati bentuk koloninya dan beberapaperlakuan untuk menguji sifat biokimianya. Sedangkan metode pewarnaan seperti pewarnaan Gram dan endospora dapat sekaligus melihat bentuk sel mikroba tersebut. Hasil ujinya kemudian dibandingkan dengan hasil uji standar, sehingga dapat diketahui genus dan spesies mikroba (Lay, 1994).
Acetobacter sp. dapat didisolasi dari nanas. Acetobacter sp merupakan bakteri gram negatif dengan sel batang pendek, tidak membentuk endospora, bersifat aerob obligat, tidak mlakukan fermentasi alkohol. Isolat-isolat murni tersebut dipelihara dalam medium agar miring. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni tersebut adalah Acetobacter sp, maka dilakukan serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu pengecatan gram, pengecatan negatif dan motilitasnya (Wedhastri, 2002).
B. Tujuan
Tujuan praktikum ini adalah mengisolasi dan mengidentifikasi Acetobacter sp. hasil isolasi dengan pendekatan mikrobiologis.
II. MATERI DAN METODE
A. Materi
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum adalah jarum ose, tabung reaksi, object glass, mikroskop, timbangan analitik, sprayer alcohol, cawan petri, tabung reaksi, pipet ukur, pipet tetes, filter, erlenmeyer, gelas ukur, label, gunting, kain kasa, kapas, wrapper, tissue, dan pisau.
Bahan yang digunakan dalam praktikum adalah buah nanas, air kelapa, gula, ZA, cuka, akuades, media YEPDA (Agar 20gr/L, Yeast extract 5 gr/L, pepton 10 gr/L, dan Dextrose 20 gr/L), media Carr (Yeast extract 30 gr/L, Agar 20 gr/L, Broomcresolgreen, etanol 20 ml, dan akuades 1000 ml), media Frateur (Yeast extract 10 gr/L, Agar 20 gr/L, etanol 20 ml, CaCO3 20 gr/L dan akuades 1000 ml), media indole, alkohol 70%, reagen tetramethyl-Dphenilenediamine dihydroclorid, reagen H2O2, satu set reagen pewarnaan gram (Crystal violet, lugol’s iodine, etanol 96%, safranin) dan spirtus.
B. Metode
Ø Isolasi Acetobacter sp. dari nanas yang terfermentasi
1. Nanas yang telah mengalami fermentasi secara alami diswab kemudian diencerkan sampai 10-7 dengan akuades.
2. Pengenceran 10-6 dan 10-7 masing-masing diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam media YEPDA cair.
3. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 300C.
Ø Pembuatan kultur murni Acetobacter sp.
1. Media HS cair yang sudah diinokulasi sebelumnya kemudian diambil sebanyak 0,1 ml dan diplating pada media HS cawan.
2. Inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 300C.
3. Pilih salah satu koloni tunggal yang memiliki karakter paling mirip dengan koloni Acetobacter sp. kemudian murnikan koloni yang dipillih dengan teknik pada media HS cawan.
4. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 300C.
Ø Pembuatan stok kultur murni Acetobacter sp.
1. Koloni tunggal yang didapatkan kemudian diinokulasikan pada media HS miring dan dilabeli tiap isolat yang didapatkan.
2. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 300C.
3. Kultur isolat disimpan pada refrigerator pada suhu 50C.
Ø Identifikasi Acetobacter sp.
Isolat yang telah didapatkan kemudian diuji baik secara morfologi maupun karakter biokimiawinya dengan menggunakan uji-uji sebagai berikut :
Pengamatan bentuk koloni1. Pengamatan bentuk koloni dapat diamati saat dilakukan kultur murni menggunakan metode streak kuadran.
2. Koloni yang diamati bentuk, margins, ukuran dan warna koloninya.
Pewarnaan Gram dan pengamatan morfologi sel1. Stok isolat diambil menggunakan ose kemudian diulaskan pada objek glass dan fiksasi.
2. Ditetesi dengan crystal violet dan ditunggu selama 60 detik lalu dicuci kering anginkan.
3. Ditetesi dengan iodine dan ditunggu selama 60 detik lalu dicuci kering anginkan.
4. Ditetesi dengan etanol 96% sampai tetesannya bening lalu dicuci kering anginkan.
5. Ditetesi dengan safranin dan ditunggu selama 45 detik lalu dicuci kering anginkan.
6. Diamati dengan mikroskop Gram positif akan berwarna biru keunguan dan Gram negatif berwarna merah.
Uji penggunaaan oksigen1. Stok isolate diinokulasikan dengan teknik inokulasi tusuk pada media YEPDA semisolid (agar 0,4%) dengan kandungan: agar 4 gr/L, yeast extract 5 gr/L, pepton 10 gr/L, dan dextrose 20 gr/L.
2. Inkubasi selama 2 x 24 jam.
3. Diamati letak koloni bakteri. Bakteri bersifat aerob bila koloni terbentuk di atas dan bersifat an aerob bila terbentuk di bawah.
Uji oksidase1. Stok bekteri diambil dengan menggunakan jarum ose dan diulaskan pada object glass dan ditutupi dengan tissue.
2. Ditetesi dengan reagen tetramethyl-D-phenylenediamine dihydrocloride. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna biru marun tidak lebih dari 10 detik.
Uji katalase1. Stok bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose dan diulaskan pada object glass.
2. Ditetesi dengan reagen H2O2.
3. Diamati dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 10x. hasil positif jika terbentuk gelembung gas.
Uji oksidasi etanol1. Stok isolate diinokulasikan pada media Carr dengan kandungan : Yeast extract 30 gr/L, Agar 20 gr/L, broomcresol green, etanol 20 ml, dan akuades 1000 ml.
2. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 300C.
3. Oksidasi etanol akan merubah warna media menjadi kuning.
4. Inkubasi tambahan selama 4 x 24 jam pada suhu 300C.
5. Overoksidasi etanol ditandai dengan kembalinya warna media menjadi warna awalnya.
Uji motilitas1. Isolat dari stok ditanam pada SIMA tegak.
2. Inkubasi pada suhu 300C selama 2 x 24 jam.
3. Amati motilitas dari pertumbuhan bakteri yang terbentuk.
Uji indole1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose.
2. Bakteri uji diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 370C.
3. Bakteri uji ditetesi KOH-alfanaftol.
4. Hasil positif jika terbentuk kompleks warna pink.
Uji penggunaan CaCO31. Stok isolat diinokulasikan pada media Frateur dengan kandungan : Yeast extract 10 gr/L, Agar 20 gr/L, etanol 20 ml, CaCO3 20 gr dan akuades 1000 ml.
2. Inkubasi selama 4 x 24 jam pada suhu 300C.
3. Bakteri dapat memanfaatkan CaCO3 sebagai sumber karbon ditandai dengan adanya zona jernih di sekitar koloni bakteri.
Ø Pengujian isolat yang didapat untuk pembentukan lapisan polisakarida atau nata.
1. Air kelapa disaring dan dipanaskan sampai mendidih.
2. Saat mendidih ditambahkan dengan gula 50 gram dan ZA sebanyak 0,1 gram lalu angkat.
3. Air kelapa yang telah ditambah dengan gula dan ZA kemudian diinolukasi dengan kultur isolat yang didapatkan.
4. Inkubasi pada suhu 300C selama 2 minggu.
5. Amati terbentuknya lapisan nata pada air kelapa.
Ø Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi
Data-data yang telah diperoleh dibandingkan dengan karakter dari bakteri yang telah diketahui.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
| No | Uji yang dilakukan | Bakteri uji | Acetobacter aceti | Acetobacter xylinum | Referensi |
| 1 | Pewarnaan gram | - | - | - | Holt et al., (2000) |
| 2 | Uji penggunaan oksigen | + | + | + | Holt et al., (2000) |
| 3 | Uji oksidase | - | - | - | Holt et al., (2000) |
| 4 | Uji katalase | + | + | + | Holt et al., (2000) |
| 5 | Uji oksidasi etanol | - | + | - | Holt et al., (2000) |
| 6 | Uji motilitas | - | + | - | Breed et al., (1974) dalam Widia (1984) |
| 7 | Uji indole | - | + | + | Holt et al., (2000) |
| 8 | Uji penggunaan CaCO3 | - | - | - | Holt et al., (2000) |
· A. aceti
· A. xylinum
Gambar:
1. Morfologi koloni bakteri 2. Pewarnaan gram (-)
3.uji penggunaan O2 4. Uji motilitas
5.Uji oksidasi etanol 6. Uji penggunaan CaCO3
7.Uji Indol 8. Pembentukan nata
9. Uji katalase 10. Starter nata
Tabel morfologi identifikasi Acetobacter sp.
| NO. | Karakter | Isolat Hasil Praktikum |
| | Ukuran | Small |
| | Permukaan | Halus mengkilap |
| | Tepi | Rata |
| | Elevasi | Cembung (convex) |
| | Pigmentasi | Tidak ada pigmentasi |
| | Karakter optic | Opaque |
| | Warna | Putih |
B. Pembahasan
Acetobacter adalah sebuah genus bakteri penghasil asam asetat, ditandai dengan kemampuannya mengubah etanol (alkohol) menjadi asam asetat (asam cuka) dengan bantuan udara. Ada beberapa bakteri dari golongan lain yang mampu menghasilkan asam asetat dalam kondisi tertentu, namun semua anggota genus Acetobacter dikenal memiliki kemampuan ini. Acetobacter dikenali dengan mudah dengan pertumbuhan koloninya di medium yang mengandung 7% etanol, dan ditambahi kalsium karbonat secukupnya untuk memburamkan medium sebagian. Ketika koloni tersebut membentuk asam asetat yang cukup, kalsium karbonat kemudian melarut sehingga terbentuk daerah bening yang jelas pada medium (Lay, 1994).
Acetobacter mengoksidasi asam asetat lebih lanjut menjadi O2 dan H2O. Bakteri asam asetat mempunyai kemampuan membentuk asam dari alkohol secara oksidasi diekspresikan ke dalam medium.Bakteri ini termasuk bakteri gram negatif yang bergerak lambat dengan flagella peritrik,memiliki toleransi terhadap asam yang tinggi,dan aktivitas peptolitik yang rendah. Fermentasi asam asetat dilakukan oleh bakteri asam asetat terhadap larutan yamg mengandung alkohol.Bakteri asam asetat tersebut termasuk dalam famili Pseudomonadaceae yang memiliki ciri-ciri sebagai berikut sel berbentuk batang pendek atau bola, bakteri gram negatif, sel bergerak dan tidak bergerak, tidak mempunyai endospora, tidak bersifat patogen, bersifat aerob, energi diperoleh dari oksidasi etanol menjadi asam asetat, mampu hidup dalam air, padatan, daun, buah, dan lain-lain. Bakteri asam asetat digolongkan menjadi peroksidan jika mampu menumpuk asetat (Bergey, 1994).
Nanas dapat difermentasikan menjadi asam asetat. Tetapi harus mengalami proses fermentasi alcohol terlebih dahulu. Pada fermentasi alcohol diperlukan mikrobia yang dapat memecah gula, sehingga proses fermentasi dapat berlangsung. Setelah alcohol terbentuk, alokohol tersebut akan dioksidasi oleh Acetobacter dan menjadi asam asetat. Proses perubahan alkohol menjadi asam asetat di sebut sebagai proses asetifikasi (Salle, 1961). Konsentrasi gula pada bahan sangat berpengaruh terhadap kadar hasil fermentasi dari gula tersebut yaitu kadar alcohol dan kadar asam organic yang terbentuk. Kadar alcohol yang terbentuk selama proses fermentasi gula jika kadarnya terlalu banyak (lebih dari 14%-15%) justru akan menghambat pertumbuhan bakteri. Dan kadar asam yang terbentuk akan mempengaruhi derajat keasaman dari larutan medium, sedangan proses fermentasi asam asetat harus dalam pH yang sesuai (Frazier, 1958).
Praktikum kali ini menggunakan sampel berupa nanas yang telah mengalami fermentasi untuk memperoleh kultur murni isolat Acetobacter sp. Isolasi Acetobacter dari nanas yang terfermentasi dilakukan dengan membusukkan nanas selama 3-4 hari yang bertujuan untuk memperoleh kultur murni isolat Acetobacter, kemudian nanas dipotong-potong dan dimasukan ke dalam botol yang di tambah air 600 ml dan gula. Setelah itu tutup dengan kain kasa selama 7 hari. Penutup botol digunakan kain kasa agar fermentasi nanas memperoleh oksigen dari luar berbeda dengan penutup botol asli karena aerasinya kurang baik. Nanas yang telah mengalami fermentasi untuk memperoleh kultur murni isolat Acetobacter sp. Nanas yang terfermentasi diswab dan dilakukan pengenceran berseri hingga 10-7 dengan akuades. Dua kali pengenceran terakhir diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam media YEPDA cair dan diinkubasi pada suhu 300 C selama 2x24 jam. Hasil dari pemurnian ini dapat diketahui bentuk morfologi dari Bakteri Asam Asetat yang diujikan yaitu diperoleh bentuk morfologi koloni yang bulat-bulat dengan permukaan cembung dan berwarna putih. Isolasi Acetobacter menggunakan nanas karena nanas mudah di temukan, harganya murah, bakteri yang terbentuk dari nanas bersifat aerob.
Pengamatan morfologi sel dari Acetobacter sp. dilakukan dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram ini dilakukan dengan menambahkan larutan gram A (Crystal Violet), gram B (iodin) dan gram C (etanol 90%) serta gram D (safranin). Pewarnaan gram ini untuk mengetahui apakah bakteri tersebut termasuk gram negatif atau positif dengan memberikan beberapa perlakuan yaitu memberikan Cristal Violet (CV) agar seluruh bakteri terwarnai baik sel vegetatif maupun endospora, lugol’s iodine untuk memperkuat ikatan dengan CV, ethanol untuk melunturkan warna ungu pada sel vegetatif, safranin berwarna merah untuk gram negatif dan saat bakteri gram positif terdeteksi maka akan berwarna ungu (Lay,1994). Hasil yang diperoleh dari pewarnaan gram ini adalah isolat berwarna merah yang menunjukan bahwa bakteri tersebut termasuk dalam gram negatif (-). Hal ini sesuai dengan pustaka karena Acetobacter bersifat gram negatif. Bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan etanol 96%, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah (Bergey, 1994).
Pengujian motilitas bakteri bagi pergerakan silia dan flagela pada mikroorganisme motil, dibutuhkan energi. Bukti yang menunjang bahwa ATP dibutuhkan untuk menggerakan flagela berasal dari penelitian sitokimiawi pada bakteri-bakteri motil (Pelczar dan Chan, 1988). Bakteri bergerak dengan cara memutar flagela berbentuk heliks. Pergerakan ini dapat disamakan dengan kotrek pembuka botol; gabus penutup botol dapat disamakan sebagai media bagi bakteri, sedangkan kotreknya sebagai flagela. Cara pergerakannya digambarkan sebagai gerakan renang yang diikuti gerakan bolak-balik, sehingga arah gerakan berbeda diikuti kembali oleh gerakan renang. Letak flagela mempengaruhi pergerakan bakteri (Lay, 1994). Uji motilitas kemarin menggunakan media SIMA (Sulphide Indole Motility Agar). SIMA merupakan media khusus untuk motilitas bakteri yang terdiri dari tryptone, meat extract, Na2S2O3.5H2O, cysteine, hydrochloride, agar, dan akuades. Praktikum motilitas yang dilakukan didapatkan hasil bahwa bakteri yang didapatkan tidak motil.
Uji penggunaan oksigen dilakukan untuk mengetahui sifat Acetobacter sp. dalam perolehannya terhadap oksigen. Uji penggunaan O2 ini dengan menumbuhkan isolat pada media YEPDA semisolid (agar 0,4%) dengan kandungan: agar 4 gr/L, yeast extract 5 gr/L, pepton 10 gr/L, dan dextrose 20 gr/L. Hasil yang diperoleh setelah diinkubasi selama 2x24 jam adalah bakteri bersifat aerob dapat tumbuh pada konsentrasi oksigen tinggi. Isolat yang didapat ditusuk pada media YEPDA, diinkubasi 2 x 24 jam. Kemudian diamati letak koloninya, bila koloni terbentuk di atas menunjukkan bakteri bersifat aerob dan bila koloni terbentuk di bawah menunjukkan bakteri bersifat anaerob. Hasil yang didapat menunjukkan Acetobacter sp. bersifat aerob. Hal ini sesuai dengan pernyataan Kuswanto dan Sudarmadji (1988) yang menyatakan golongan Acetobacter sp. mempunyai sifat aerob. Menurut Hadioetomo (1990) bakteri dapat dibagi menjadi beberapa kelompok umum berdasarkan kebutuhan akan oksigen. Kelompok pertama, yaitu yang betul-betul aerob, memerlukan oksigen bebas untuk hidupnya.
Uji katalase dilakukan dengan meneteskan reagen H2O2 pada preparat ulas yang telah dibuat, hasil dari uji ini yaitu positif atau menghasilkan gelembung. Hal ini terjadi dengan reaksi H2O2 berubah menjadi H2O dan Oksigen. Menurut (Lay, 1994) hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktifkan enzim dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut. Penentuan adanya katalase diuji dengan larutan H2O2 pada koloni terpisah. Bakteri yang bersifat katalase positif terlihat pembentukkan gelembung udara di sekitar koloni. Reaksi kimiawi yang dikatalisis oleh enzim katalase adalah:
Uji oksidase dilakukan dengan meneteskan reagen oksidase yang sebelumnya object glass di beri tisue, hasil dari uji ini yaitu negatif ditandai dengan tidak berwarna biru marun.
Uji indole untuk uji protein dengan kandungan tripton 2 gr sebagai sumber nitrogen, beef extract sebagai sumber karbon, dan aquades 1000ml/L. Hasil yang diperoleh negatif, tidak terbentuk kompleks warna pink, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber carbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovacs.. Menurut Hadioetomo (1990), adanya indol dapat diketahui dengan menggunakan reagen kovac, uji positif ditunjukkan pula oleh terbentuknya lapisan berwarna merah diatas biakan. Untuk uji ini biasanya digunakan kaldu tripton (1%) karena medium ini mengandung banyak tiptofan. Tripton ialah suatu pepton yang berasal dari kasein yang mengalami perombakan pankreatik.
Pada bakteri tertentu seperti E. coli dapat menghidrolisis asam amino triptofan menjadi indole dan asam piruvat melalui kerja enzim triptofase. Media indole biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein.
Uji penggunaan CaCO3 menggunakan media frateur dengan komposisi yeast extract 10 gr sebagai sumber nitrogen, etanol 20 ml untuk menciptakan suasana asam, CaCO3 20 gr sebagai sumber karbon dan buffer, agar 20 gr/L sebagai pemadat dan aquades 1000 ml sebagai pelarut. Hasil yang diperoleh dari uji penggunaan CaCO3 adalah negatif, yaitu tidak terbentuk zona jernih di sekitar koloni.
Uji oksidasi etanol menggunakan media Carr dengan kandungan yeast extract 30 gr/L sebagai sumber nitrogen, agar 20 gr/L sebagai pemadat, broomcresol green sebagai indikator warna, etanol 20mL menciptakan suasana asam dan aquades 1000 mL sebagai pelarut. Hasil yang diperoleh negatif yang artinya tidak terjadi perubahan warna. Hal ini berbeda dengan pendapat Timotius (1982) yang menyatakan Acetobacter mempunyai kemampuan khusus yang jarang dilakukan oleh bakteri lainnya, yaitu dapat menggunakan etanol sebagai substratnya. Etanol akan dioksidasi secara tidak sempurna menjadi asam asetat.
Uji pembentukan lapisan polisakarida atau lapisan nata hasil yang diperoleh tidak terbentuk lapisan nata karena pada saat menuangkan starter media masih dalam keadaan panas atau hangat sehingga didapat terkontaminasi baik terkontaminasi jamur maupun kontaminasi bakteri di udara. Nata merupakan hasil fermentasi air kelapa dengan bantuan mikroba Acetobacter xylinum, yang berbentuk padat, berwarna putih, transparan, berasa manis dan bertekstur kenyal (Hasbullah, 2001). Menurut Sulistyo (2007), nata adalah kumpulan sel bakteri (selulosa) yang mempunyai tekstur kenyal, putih, menyerupai gel dan terapung pada bagian permukaan cairan (nata tidak akan tumbuh di dalam cairan). Bahan yang dapat digunakan sebagai media untuk pembuatan nata adalah air kelapa sehingga produknya dikenal dengan nata de coco. Selain itu bahan lainnya adalah sari nanas (nata de pina), kedelai (nata de soya) atau buah lain yang mengandung glukosa. Mikroba yang aktif dalam pembuatan nata adalah bakteri pembentuk asam asetat yaitu Acetobacter xylinum. Mikroba ini dapat mengubah gula menjadi selulosa. Jalinan selulosa inilah yang membuat nata terlihat putih.
Acetobacter xylinum dalam pertumbuhan dan aktivitasnya membentuk nata memerlukan suatu media yang tepat memiliki kandungan komponen-komponen yang dibutuhkan sehingga produksi nata yang dihasilkan dapat secara optimal. Komponen media nata yang dibutuhkan sebagai syarat media nata antara lain memiliki sumber karbon dapat berupa gula, sumber nitrogen dapat berupa penambahan urea atau ZA, mineral dan vitamin yang mendukung pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinum. Menurut Breed et al (1957), spesies Acetobacter yang telah dikenal antara lain Acetobacter aceti, Acetobacter orleansis, Acetobacter liquefaciens dan Acetobacter xylinum. Faktor lain yang dominan mempengaruhi sifat fisiologi dalam pembentukan nata adalah ketersediaan nutrisi, derajat keasaman, temperatur, dan ketersediaan oksigen. Digunakan kelapa tua karena air kelapa tua memiliki kandungan nutrisi yang baik bagi pertumbuhan Acetobacter xylium. Kandungan tersebut (per 100 gram) antara lain : Protein (g) 0,14, Lemak (g) 1,50, Karbohidrat (g) 4,60, Kalsium (mg) 15,00, Phosfor (mg) 0,50, Besi (mg) 0,20, Vitamin C (mg) 1,00, Air (g) 91,50 (Sudarmadji, 1997).
Berdasarkan hasil identifikasi secara mikrobiologis didapat perhitungan yang dapat diartikan, bahwa Acetobacter xylinum memiliki kesamaan dengan bakteri uji dengan persen homologi sebesar 87,5 %. Acetobacter xylinum merupakan bakteri berbentuk batang pendek, yang mempunyai panjang 2 mikron dan lebar , micron, dengan permukaan dinding yang berlendir. Bakteri ini membentuk rantai pendek dengan satuan 6-8 sel. Bersifat nonmotil dan dengan pewarnaan gram menunjukkan gram negatif. Bakteri ini tidak membentuk endospora maupun pigmen (Zaar, 1979). Pada kultur sel yang masih muda, individu sel berada sendiri-sendiri dan transparan. Koloni yang sudah tua membentuk lapisan menyerupai gelatin yang kokoh menutupi sel koloninya. Pertumbu-han koloni pada medium cair setelah 48 jam inokulasi akan membentuk lapisan pelikel dan dapat dengan mudah diambil dengan jarum oase.
Bakteri ini dapat membentuk asam dari glukosa, etil alkohol, dan propel alko-hol, tidak membentuk indol dan mempunyai kemampuan mengoksidasi asam asetat men-jadi CO2 dan H2O. Sifat yang paling menonjol dari bakteri itu adalah memiliki kemampuan untuk mempolimerisasi glukosa sehingga menjadi selulosa, selanjutnya selulosa tersebut membentuk matrik yang dikenal sebagai nata. Bakteri Acetobacter xylinum mengalami pertumbuhan sel. Pertumbuhan sel ini didefinisikan sebagai pertumbuhan secara teratur semua komponen di dalam sel hidup. Bakteri Acetobacter xylinum mengalami beberapa fase pertumbuhan sel yaitu fase adaptasi, fase pertumbuhan awal, fase pertumbuhan eksponensial, fase pertumbuhan lambat, fase pertumbuhan tetap, fase menuju kematian, dan fase kematian (Sulistyo, 2010).
Bakteri ini dapat membentuk asam dari glukosa, etil alkohol, dan propel alko-hol, tidak membentuk indol dan mempunyai kemampuan mengoksidasi asam asetat men-jadi CO2 dan H2O. Sifat yang paling menonjol dari bakteri itu adalah memiliki kemampuan untuk mempolimerisasi glukosa sehingga menjadi selulosa, selanjutnya selulosa tersebut membentuk matrik yang dikenal sebagai nata. Bakteri Acetobacter xylinum mengalami pertumbuhan sel. Pertumbuhan sel ini didefinisikan sebagai pertumbuhan secara teratur semua komponen di dalam sel hidup. Bakteri Acetobacter xylinum mengalami beberapa fase pertumbuhan sel yaitu fase adaptasi, fase pertumbuhan awal, fase pertumbuhan eksponensial, fase pertumbuhan lambat, fase pertumbuhan tetap, fase menuju kematian, dan fase kematian (Sulistyo, 2010).
Acetobacter sp. adalah bakteri gram negatif, pada praktikum ini hasil pewarnaan gram sesuai dengan pernyataan Zaar (1979), yaitu bakteri gram negatif menunjukkan warna merah pada pewarnaan gram. Jika pada praktikum menunjukkan hasil positif, dapat dikarenakan bakteri gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan etanol 96%, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah (Bergey, 1994).
Hasil uji penggunaan O2 menunjukkan bakteri bersifat aerob, hal ini sesuai dengan pustaka bahwa Acetobacter bersifat aerob obligat. Jika hasil tidak menunjukkan adanya cincin pada bagian atas media YEPDA semi solid, maka bukan Acetobacter. Uji motilitas menunjukkan bahwa bakteri bersifat non motil. Ada dua kemungkinan bakteri, A. xylinum bersifat non motil sedangkan A. aceti bersifat motil. Uji oksidasi etanol pada media Carr menunjukkan tidak ada perubahan warna sehingga hasilnya negatif, kemungkinan yang terjadi adalah komposisi media Carr yang tidak tepat. Uji oksidasi etanol seharusnya menunjukkan di sekitar streak berwarna hijau kekuningan. Uji indole menunjukkan hasil negatif tidak terbentuk cincin, hal ini terjadi karena bakteri tidak membentuk indol dari triptofan sebagai sumber nitrogen. Uji katalase menunjukkan hasil positif karena terbentuk gelembung udara. Hasil negative untuk uji oksidase karena tidak terbentuk warna biru marun. Kemungkinan positif jika pada waktu pemberian reagen oksidase dalam waktu 10 detik menunjukkan warna biru marun. Uji penggunaan CaCO3 menunjukkan hasil negative yaitu tidak terbentuk zona jernih di sekitar koloni, hasil positif jika terbentuk zona jernih.
Pembuatan starter nata pada praktikum ini, didapatkan kontaminasi jamur. Hal ini mungkin disebabkan karena pada saat penginokulasian kurang aseptis, kurangnya aerasi karena ditutup menggunakan alumunium foil, saat menuangkan starter media masih dalam keadaan panas atau hangat sehingga menimbulkan adanya uap air yang akan menjadikan terbentuknya jamur, terkontaminasinya faktor komponen media nata yang dibutuhkan sebagai syarat media nata antara lain memiliki sumber karbon berupa gula, sumber nitrogen dapat berupa penambahan urea atau ZA, mineral dan vitamin yang mendukung pertumbuhan bakteri. Pada fermentasi nata kondisi lingkungan juga sangat berpengaruh karena bakteri Acetobacter sp. memiliki kondisi optimum lingkungannya untuk tumbuh baik itu suhu, pH, cahaya, dan oksigen (Hasbullah, 2001).
BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil dan pembahasan maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :
1. Hasil identifikasi dengan pendekatan secara mikrobiologis didapat perhitungan yang diartikan bahwa bakteri Acetobacter xylinum yang paling banyak memiliki kecocokan dengan hasil identifikasi bakteri uji, yaitu persen homologi sebesar 87,5 %.
2. Acetobacter xylinum merupakan bakteri berbentuk batang pendek, yang mempunyai panjang 2 mikron dan lebar , micron, dengan permukaan dinding yang berlendir. Bakteri ini membentuk rantai pendek dengan satuan 6-8 sel. Bersifat nonmotil dan dengan pewarnaan gram menunjukkan gram negatif. Bakteri ini tidak membentuk endospora maupun pigmen. Pada kultur sel yang masih muda, individu sel berada sendiri-sendiri dan transparan.
B. Saran
Acetobacter sp. merupakan salah satu bakteri yang banyak dijumpai. Saat ini telah banyak riset yang meneliti pemanfaatan bakteri dalam industri pangan, namun belum banyak diaplikasikan. Diharapkan bakteri Acetobacter sp yang telah banyak diketahui sifat-sifatnya ini dapat diaplikasikan dalam dunia industri pangan tidak hanya untuk pembuatan nata. Pada waktu praktikum, asisten seharusnya memberi kesempatan yang sama untuk semua praktikan agar dapat menguasai praktikum dengan sama baiknya.
DAFTAR REFERENSI
Barrow, G. I, and Feltham, R. K. A. 1993. Cowan and Steel’s for the Identification of Medical Bacteria. Cambridge University Press, USA.
Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (edisi ke-9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-7.
Bisset, K.A. 1963. Bacteria. Third Edition. E.&S. Livingstone: Edinburg & London.
Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobilogi Pangan dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Gramedia, Jakarta.
Hasbullah, 2001, Teknologi Tepat Guna Agroindustri Kecil Sumatera Barat, Dewan Ilmu Pengetahuan, Teknologi dan Industri Kecil Sumatera Barat. Jakarta.
Holt, J. G., N. R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, and S. T. Williams. 2000. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition. Lippincott Williams and Wilkins, Pilladelphia, USA.
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikrobiologi di Laboratorium. Raja Grafindo Persada, Jakarta.
Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi jilid 1. Universitas Indonesia, Jakarta.
Salle, A.J. 1961. Fundamentals Principles of Bacteriology. McGraw-Hill Book Company, New York.
Sudarmadji, S. dan Kuswanto, K. R. 1988. Proses-Proses Mikrobiologi Pangan. PAU Pangan dan Gizi-Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.
Sulistyo, et.al,. 2007. Pembuatan nata dari limbah cair tahu dengan menggunakan Molases sebagai sumber karbon Acetobacter xylinum. Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Sebelas Maret.
Timotius, K. H. 1982. Mikrobiologi Dasar. Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga.
Wedhastri S., 2002. Isolasi dan Seleksi Azotobacter Spp. penghasil faktor tumbuh dan penambat nitrogen dari tanah masam. Jurnal Ilmu Tanah dan Lingkungan. Vol 3 (1) pp 45-51.
E ENVELOPE OF THE GRAM-NEGATIV
Zaar, K. 1979. Cellulo visualization of pores (export sites) correlated with Cellulose production in the envelope of the gram-negative Bacterium Acetobacter xylinum. Freiburg i. Br., germanyse production in.
Langganan:
Postingan (Atom)